PERCOBAAN
V
JUDUL PRAKTIKUM : KROMATOGRAFI KOLOM
TANGGAL PERCOBAAN : 28 November 2016
1.
Latar Belakang
1.1
Definisi Kromatografi Kolom
Menurut Gritter (1991: 91) kromatografi kolom merupakan
metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom
digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan
adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel
G-60, kieselgur, Al2O3,
dan diaion.
Menurut Yazid (2005: 98) kromatografi kolom adalah
kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan
komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang
dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair,
ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum
perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya
adalah 25-30 kali berat bahan yang akan dipisahkan. Teknik banyak digunakan
dalam pemisahan senyawa-senyawa organik dan konstituen-konstituen yang sukar
menguap sedangkan untuk pemisahan jenis logam-logam atau senyawa anorganik
jarang dipakai.
Menurut Hendayana
(2006: 2-3) metode pemisahan kromatografi kolom ini adalah suatu metode
yang memerlukan bahan kimia yang cukup
banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas.
Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan
waktu yangcukup lama, bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran.
Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar
mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang
tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir
fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel
yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga
tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas.
Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam
bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak
mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat
digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi
fasa diam.
Berdasarkan beberapa pendapat diatas maka dapat
disimpulkan bahwa kromatografi kolom merupakan
suatu teknik pemurnian komponen dari suatu campurannya dengan
menggunakan alat yang dinamakan sebagai kolom. Dalam
kolom terjadi proses pemisahan campuran yang berkolaborasi dengan fase diam dan
fase gerak. Fase diam pada kromatografi kolom dapat berupa silika gel sedangkan
fase geraknya dapat berupa pelarut yang
bersifar polar, non polar maupun semipolar.
1.2
Mengapa Perlu Dilakukannya Metode Kromatografi
Kolom?
Metode kromatografi kolom digunakan untuk memurnikan bahan kimia
tunggal dari campurannya. Dimana metode ini biasanya sering digunakan untuk
aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Kemudahan pembuangan
fase diam ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fase diam akibat
pemakaian ulang. Kromatografi kolom mempunyai aliran tetap
untuk semua eluat yang melalui detektor dengan berbagai macam konsentrasi,
harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi sampel terelusi melawan
waktu. Plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut dengan kromatogram.
1.3
Penelitian
Terdahulu Tentang Kromatografi Kolom
Penelitian lainnya yang berkaitan dengan percobaan ini
juga telah dilakukan oleh Sayekti (2013:133) “Isolasi
Rhodinol dari Minyak Sereh Jawa Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan”. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi rhodinol
dari minyak sereh Jawa menggunakan metode kromatografi kolom tekan (KKT) dengan
menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat secara bergradien. Selanjutnya
hasil pemisahan diidentifikasi dengan spektrofotometer IR dan spektrofotometer
GC-MS. Metode yang dilakukan pada percobaan ini adalah dengan menggunakan
kromatografi kolom tekan.
Tahap
pertama disiapkan kolom dengan tinggi 30 cm yang berdiameter 2 cm lalu
dimasukkan silika gel 60 (230 – 400 mesh yang terlebih dahulu direndam
toluen) dengan tinggi 20 cm. Sebanyak 5 mL
sampel yang telah dilarutkan dalam 3 mL toluen dimasukkan ke dalam kolom yang
telah diisi silika dan dielusi menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat
bergradien. Komposisi eluen yang digunakan adalah toluen 100% dan toluen : etil asetat = 12:0,1 ; 12:0,5
dan
12:0,7. Tetes eluat ditampung tiap 5 mL/vial pada 5 botol vial
pertama dan 3 mL/vial untuk vial berikutnya sehingga diperoleh beberapa fraksi.
Setiap fraksi diuji dengan KLT dengan komposisi eluen yaitu toluen : etil asetat (12:0,1) lalu
disemprot dengan larutan vanilin sebagai penampak noda dan dipanaskan. Setiap
noda yang sama digabungkan dan dilakukan KLT kembali. Setelah dua kali
pemisahan melalui kolom tekan, isolat dengan noda utama (mayor) dan terpisah
dengan baik. Hasil KKT menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat
(12:0,1) (analisis KLT menggunakan plat silika gel; tebal 0,25 mm; jarak elusi
4 cm; penampak noda vanilin; dipanaskan) diperoleh 233 fraksi.
Penelitian lain juga dilakukan oleh Sari (2015) dalam jurnal “Fraksinasi dan Identifikasi
Senyawa Antioksidan pada Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) secara
Kromatografi Kolom”. Pada penelitian
ini akan dilakukan fraksinasi ekstrak etanolik daun sirsak dengan metode
kromatografi kolom. Daun sirsak
dicuci bersih dan dikeringkan dengan diangin-anginkan, kemudian digiling sampai
terbentuk serbuk simplisia. Satu kg serbuk dimaserasi selama 1 hari terlebih
dahulu dengan pelarut etanol 96%. Selanjutnya serbuk dipindahkan ke dalam
perkolator sampai didapat ekstrak cair. Ekstrak etanol daun sirsak dipekatkan
dengan menggunakan pemanas diatas water bath pada suhu 50°C sampai didapatkan
ekstrak kental. Ekstrak kental kemudian dilakukan standardisasi ekstrak dan
dilakukan pemilihan fase gerak menggunakan beragam jenis (n-heksan, kloroform,
etil asetat dan etanol) dan komposisi (1:9 ; 5:5 ; 9:1) eluen. Fase gerak yang
terpilih digunakan pada kromatografi kolom.
Pada hasil pemeriksaan organoleptis didapatkan warna hijau
kehitaman dengan bentuk ekstrak kental. Pada pemeriksaan kadar air diperoleh
hasil 6,26%. Hal ini sesuai dengan batas persyaratan yaitu kurang dari 10%
(DirJen POM RI, 2000). Pemeriksaan kadar air ini bertujuan untuk mengetahui
besarnya kandungan air dalam ekstrak etanol. Pada penetapan kadar abu ekstrak
diperoleh hasil 5,78%. Penetapan ini ber-tujuan untuk mengetahui gambaran
kandungan mineral yang berasal dari simplisia kering sampai terbentuknya
ekstrak. Dari beberapa variasi fase gerak yang dicobakan, didapatkan hasil
bahwa kloroform : etil asetat merupakan fase gerak terpilih yang dapat
memberikan keterpisahan noda yang banyak dan memberikan spektrum daya
antioksidan yang paling luas. Eluen yang terpilih tersebut akan digunakan untuk
fraksinasi dengan metode kromatografi kolom.
Selanjutnya penelitian secara kromatografi kolom juga
dilakukan oleh Hayani (2007) dalam jurnal “Pemisahan Komponen Rimpang Temu
Kunci Secara Kromatografi Kolom”. Pemisahan komponen rimpang temu kunci
secara kromatografi kolom bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa
kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa aktifnya. Untuk pengisian
kolom, sebagai bahan pengisi bagian bawah kolom dimasukkan sedikit kapas, wol
kaca dan pasir laut kemudian dimasukkan bubur silica gel 70-230 mesh sambil
diaduk agar tidak terdapat rongga udara di tengahtengah kolom. Timbunan bubur
silica gel dalam kolom mencapai tiga perempat tinggi kolom.
Untuk pemisahan komponen dengan menggunakan kromatografi
kolom, mula-mula ke dalam kromatografi kolom dialirkan ekstrak rimpang temu
kunci, kemudian kran kromatografi kolom dibuka. Ekstrak
akan meresap ke silica gel dalam kolom sampai batas atas silika gel. Setelah
itu dimasukkan pereaksi terus-menerus sambil kran kolom dibuka. Fraksi yang terpisah
ditampung dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml sampai seluruh ekstrak terpisahkan. Dari hasil
analisis mutu simplisia temu kunci diperoleh kadar sari yang terlarut dalam air
4,35%, lebih besar dibanding kadar sari yang terlarut dalam alkohol (2,24%).
Hal ini menunjukkan simplisia temu kunci mudah larut dalam air. Kadar abu
sangat kecil yaitu 0,41%, yang menunjukkan bahwa simplisia temu kunci sangat
sedikit tercemar bahan asing seperti pasir.
2.
TUJUAN PERCOBAAN
Adapun tujuan dari kromatografi kolom yaitu
pemisahan komponen campuran zat berdasarkan afinitas terhadap komponen zat
terhadap fasa diam (zat penyerap).
3.
TINJAUAN PUSTAKA
1.1.
Silika Gel
Kurk Silika gel adalah substansi-substansi yang digunakan untuk menyerap
kelembaban dan cairan partikel dari ruang yang berudara/bersuhu. Silika gel
juga membantu menahan kerusakan pada barang-barang yang mau disimpan. Silika
gel lebih sering digunakan dibandingkan activated
carbon untuk beberapa senyawaan, seperti:
·
Senyawaan polar, akan lebih mudah didesorpsi
dari silica gel dibandingkan charcoal.
·
Senyawaan amina, senyawaan nitro dan beberapa
senyawaan anorganik (contoh ; Acid mist) tidak dapat dikumpulkan pada charcoal.
Salah satu kelemahan utama silica gel adalah higroskopis
(mudah menyerap air). Silika gel mempunyai afinitas yang tinggi terhadap air.
Jika pengambilan sampel dilakukan pada atmosfer yang lembab, maka uap air akan
diadsorpsi pada silica gel, sehingga mengurangi kapasitas adsorpsinya. Bahkan
apabila kelembapan sangat tinggi, dan karena air memiliki polaritas yang tinggi
dapat menggantikan senyawaan yang kurang polar yang telah teradsorpsi pada
silica gel, sehingga hasil pengukuran menjadi berbeda (Lestari, 2010).
1.2.
Prinsip Kromatografi Kolom
Prinsip metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak
sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk
melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu
yang cukup lama, bisa berjam-jam hanya
untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan
pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih
dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa
gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang
cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relatif kecil sehingga tempat
untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas.
Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam
bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak
mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat
digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi
fasa diam (Hendayana, 2006: 2-3).
Untuk memisahkan campuran, kolom yang telah dipilih
sesuai campuran diisi dengan bahan penyerap seperti alumina dalam keadaan
kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan
bantuan batang pengaduk untuk memanfaatkan adsorben dan gelas wool pada dasar
kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata
sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas
biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok.
Sejumlah cuplikan yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas
kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam
campuran diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa
pita sempit pada permukaan atas kolom. Dengan penambahan pelarut secara
terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan
pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap,
komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap apabila suatu
komponen yang satu dengan yang lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan
waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan (Yazid, 2005:
200-201).
 |
| Kromatografi Kolom |
4.
ALAT DAN BAHAN
4.1. ALAT
No
|
Nama Alat
|
Ukuran
|
Jumlah
|
Gambar
|
|||
1
|
Timbangan
|
-
|
1
|
||||
2
|
Gelas ukur
|
25 mL
|
1
|
||||
3
|
Kolom kromatografi
|
-
|
1
|
||||
4
|
Gelas kimia
|
100 mL
|
1
|
||||
6
|
Batang pengaduk
|
15 cm
|
1
|
||||
7
|
Spatula
|
15 cm
|
1
|
||||
8
|
Pipet tetes
|
-
|
1
|
||||
9
|
Kaca arloji
|
-
|
1
|
4.2. BAHAN
No
|
Nama Bahan
|
Ukuran
|
Gambar
|
|||
1
|
Silikon oksida
|
20 gram
|
||||
2
|
1-Butanol
|
20 mL
|
||||
3
|
KMnO4
|
2,5 mL
|
||||
4
|
K2Cr2O7
|
2,5 mL
|
||||
5
|
Aqua dm
|
100 mL
|
5.
PROSEDUR KERJA DAN PENGAMATAN
No
|
Prosedur Kerja
|
Pengamatan
|
Reaksi
|
|||
1
|
Ke dalam kolom yang
bersih, dimasukkan penyerap silika gel yang dibasahi dengan air (menjadi larutan kental)
setinggi 10 cm.
|
-
|
||||
2
|
Ditambahkan
pelarut 1-butanol (eluen) hingga mencapai 1 cm diatas permukaan penyerap (jaga agar penyerap jangan sampai
kering).
|
-
|
||||
3
|
Dimasukkan
5 ml sampel (campuran larutan KMnO4 dan larutan K2Cr2O7).
|
-
|
||||
4
|
Dimasukkan
fase diam dan fase gerak kedalam kolom. Sehingga terjadi proses fraksinasi.
|
-
|
6.
PEMBAHASAN
Percobaan ini dilakukan dengan
metode kromatografi kolom, untuk memisahkan campuran larutan antara kalium
permanganat dan larutan kalium dikromat yang telah dihomogenkan. Fase diam yang
digunakan adalah silika gel sedangkan fase gerak yang digunakan adalah pelarut
1-butanol. Silika gel digunakan sebagai fase
diam karena silika gel memiliki pori-pori dan tidak mudah bereaksi dengan
senyawa-senyawa organik pada kolom.
Pelarut 1-butanol merupakan senyawa organik polar, Dicampurkan larutan KMnO4 dan K2Cr2O7
kedalam gelas kimia maka dihasilkan larutan berwarna merah darah. Lalu
dimasukkan larutan tersebut kedalam kolom yang sudah berisi silika gel. Sampel tersebut membutuhkan waktu lama untuk menuruni
kolom (proses fraksinasi lama), tetapi ketika ditambahkan 1-butanol
komponen-komponen sampel sangat cepat menuruni kolom. Hal
ini terjadi karena perbedaan kepolaran antara 1-butanol dan sampel yang
dianalisis, dimana 1-butanol lebih polar daripada sampel sehingga 1-butanol
mempunyai kemampuan berikatan lebih besar dengan sampel. Ini berarti sampel
harus diserap secara
kuat pada silika gel dibandingkan dengan 1-butanol sehingga 1-butanol lebih
dahulu menuruni kolom. Hasil yang diperoleh pada percobaan ini berupa 3 fraksi.
Fraksi pertama merupakan larutan tidak bewarna, kedua larutan bewarna kuning
dan ketiga larutan berwarna ungu.
Hasil percobaan diatas sesuai dengan teori yang
menyatakan bahwa pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan
waktu yang cukup lama, bisa berjam-jam
hanya untuk memisahkan satu campuran (Hendayana, 2006:2-3). Kemudian hasil ini juga sesuai dengan
penelitian yang telah dilakukan oleh Endah Sayekti, Ajuk Sapar, Titin Anita
Zaharah dan
Fitririyanti (2013:133) “Isolasi Rhodinol dari Minyak Sereh Jawa
Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan”. Kromatografi kolom terbagi dua, yaitu kromatografi fasa normal
dan kromatografi fasa terbalik, percobaan ini menggunakan kromatografi fasa
terbalik. Kromatografi fasa terbalik yaitu adsorben yang digunakan bersifat
nonpolar, sedangkan eluennya bersifat polar dan sampel juga bersifat polar. Silika gel yang merupakan adsorben bersifat nonpolar,
sedangkan 1-butanol sebagai eluen dan KMnO4 dan K2Cr2O7
sebagai sampel bersifat polar. Hal ini sesuai
dengan metode yang digunakan pada percobaan ini kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel yang bersifat nonpolar dan
fasa gerak yaitu toluen 100% dan toluen
: etil asetat = 12:0,1 ; 12:0,5 dan 12:0,7 yang bersifat polar. Sehingga pada kedua percobaan ini menghasilkan
beberapa fraksi. Fraksi awal yang akan keluar merupakan senyawa nonpolar
kemudian diikuti dengan senyawa yang bersifat semipolar dan selanjutnya senyawa
bersifat polar.
7.
PENUTUP
7.1. Kesimpulan
Berdasarkan
hasil percobaan terjadi pemisahan senyawa KMnO4 dan senyawa K2Cr2O7
berdasarkan afinitas terhadap senyawa tersebut dengan fase diam berupa silika
gel dan fase gerak berupa pelarut 1-butanol diperoleh 3 fraksi yaitu larutan
1-butanol, larutan kalium dikromat, dan kalium permanganat. Metode ini dapat memisahkan antara senyawa yang polar dan nonpolar.
Senyawa yang non polar akan lebih cepat keluar dari keran kolom daripada
senyawa yang polar.
7.2. Saran
· Praktikan harus membasahi silika gel yang
sudah dimasukkan kedalam kolom, agar kolom tidak retak atau pecah.
· Diharapkan untuk menggunakan pelarut eter
dan metanol dengan perbandingan 1:1 dan etanol dan kloroform dengan
perbandingan 1:1.
· Gunakanlah fase diam berupa
aluminium oksida.
· Pengisian bahan penyerap harus dilakukan
secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar dari
gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas biasanya kolom setelah
diisi divibrasi diketok-ketok.
8.
DAFTAR PUSTAKA
Diyan Maya Sari, Sumi Wijaya, Henry Kurnia Setiawan. 2015. Fraksinasi dan
Identifikasi Senyawa antioksidan pada Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona
muricata L.) secara Kromatografi Kolom. Jurnal Farmasi Sains Dan Terapan, Vol. 2, No. 2.
Endah
Sayekti, Ajuk Sapar, Fitririyanti, Titin Anita Zaharah. 2013. Isolasi Rhodinol
dari Minyak Sereh Jawa Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan. Semirata,
Vol, 2. No, 1.
Eni
Hayani. 2007. Pemisahan Komponen Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi Kolom. Buletin
Teknik Pertanian, Vol. 12 No. 1.
Gandjar,
Ibnu Gholib dan Abdul Rohma., 2007. Kimia
Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka pelajar.
Hendayana,
Sumar. 2006. Kimia Pemisahan.
Bandung: Remaja Rosdakarya.
Roy
J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB.
Yazid,
Estien. 2005. Kimia Fisika Paramedis.
Yogyakarta: Andi.
0 komentar:
Posting Komentar