PERCOBAAN V
JUDUL PRAKTIKUM : KROMATOGRAFI KOLOM
TANGGAL PERCOBAAN : 28 November 2016
1. Latar Belakang
1.1 Definisi Kromatografi Kolom
Menurut Gritter (1991: 91) kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan diaion.
Menurut Yazid (2005: 98) kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair, ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya adalah 25-30 kali berat bahan yang akan dipisahkan. Teknik banyak digunakan dalam pemisahan senyawa-senyawa organik dan konstituen-konstituen yang sukar menguap sedangkan untuk pemisahan jenis logam-logam atau senyawa anorganik jarang dipakai.
Menurut Hendayana (2006: 2-3) metode pemisahan kromatografi kolom ini adalah suatu metode yang memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yangcukup lama, bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam.
Berdasarkan beberapa pendapat diatas maka dapat disimpulkan bahwa kromatografi kolom merupakan suatu teknik pemurnian komponen dari suatu campurannya dengan menggunakan alat yang dinamakan sebagai kolom. Dalam kolom terjadi proses pemisahan campuran yang berkolaborasi dengan fase diam dan fase gerak. Fase diam pada kromatografi kolom dapat berupa silika gel sedangkan fase geraknya dapat berupa pelarut yang bersifar polar, non polar maupun semipolar.
1.2 Mengapa Perlu Dilakukannya Metode Kromatografi Kolom?
Metode kromatografi kolom digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari campurannya. Dimana metode ini biasanya sering digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Kemudahan pembuangan fase diam ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fase diam akibat pemakaian ulang. Kromatografi kolom mempunyai aliran tetap untuk semua eluat yang melalui detektor dengan berbagai macam konsentrasi, harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi sampel terelusi melawan waktu. Plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut dengan kromatogram.
1.3 Penelitian Terdahulu Tentang Kromatografi Kolom
Penelitian lainnya yang berkaitan dengan percobaan ini juga telah dilakukan oleh Sayekti (2013:133) “Isolasi Rhodinol dari Minyak Sereh Jawa Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan”. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi rhodinol dari minyak sereh Jawa menggunakan metode kromatografi kolom tekan (KKT) dengan menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat secara bergradien. Selanjutnya hasil pemisahan diidentifikasi dengan spektrofotometer IR dan spektrofotometer GC-MS. Metode yang dilakukan pada percobaan ini adalah dengan menggunakan kromatografi kolom tekan.
Tahap pertama disiapkan kolom dengan tinggi 30 cm yang berdiameter 2 cm lalu dimasukkan silika gel 60 (230 – 400 mesh yang terlebih dahulu direndam toluen) dengan tinggi 20 cm. Sebanyak 5 mL sampel yang telah dilarutkan dalam 3 mL toluen dimasukkan ke dalam kolom yang telah diisi silika dan dielusi menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat bergradien. Komposisi eluen yang digunakan adalah toluen 100% dan toluen : etil asetat = 12:0,1 ; 12:0,5 dan 12:0,7. Tetes eluat ditampung tiap 5 mL/vial pada 5 botol vial pertama dan 3 mL/vial untuk vial berikutnya sehingga diperoleh beberapa fraksi. Setiap fraksi diuji dengan KLT dengan komposisi eluen yaitu toluen : etil asetat (12:0,1) lalu disemprot dengan larutan vanilin sebagai penampak noda dan dipanaskan. Setiap noda yang sama digabungkan dan dilakukan KLT kembali. Setelah dua kali pemisahan melalui kolom tekan, isolat dengan noda utama (mayor) dan terpisah dengan baik. Hasil KKT menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat (12:0,1) (analisis KLT menggunakan plat silika gel; tebal 0,25 mm; jarak elusi 4 cm; penampak noda vanilin; dipanaskan) diperoleh 233 fraksi.
Penelitian lain juga dilakukan oleh Sari (2015) dalam jurnal “Fraksinasi dan Identifikasi Senyawa Antioksidan pada Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) secara Kromatografi Kolom”. Pada penelitian ini akan dilakukan fraksinasi ekstrak etanolik daun sirsak dengan metode kromatografi kolom. Daun sirsak dicuci bersih dan dikeringkan dengan diangin-anginkan, kemudian digiling sampai terbentuk serbuk simplisia. Satu kg serbuk dimaserasi selama 1 hari terlebih dahulu dengan pelarut etanol 96%. Selanjutnya serbuk dipindahkan ke dalam perkolator sampai didapat ekstrak cair. Ekstrak etanol daun sirsak dipekatkan dengan menggunakan pemanas diatas water bath pada suhu 50°C sampai didapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental kemudian dilakukan standardisasi ekstrak dan dilakukan pemilihan fase gerak menggunakan beragam jenis (n-heksan, kloroform, etil asetat dan etanol) dan komposisi (1:9 ; 5:5 ; 9:1) eluen. Fase gerak yang terpilih digunakan pada kromatografi kolom.
Pada hasil pemeriksaan organoleptis didapatkan warna hijau kehitaman dengan bentuk ekstrak kental. Pada pemeriksaan kadar air diperoleh hasil 6,26%. Hal ini sesuai dengan batas persyaratan yaitu kurang dari 10% (DirJen POM RI, 2000). Pemeriksaan kadar air ini bertujuan untuk mengetahui besarnya kandungan air dalam ekstrak etanol. Pada penetapan kadar abu ekstrak diperoleh hasil 5,78%. Penetapan ini ber-tujuan untuk mengetahui gambaran kandungan mineral yang berasal dari simplisia kering sampai terbentuknya ekstrak. Dari beberapa variasi fase gerak yang dicobakan, didapatkan hasil bahwa kloroform : etil asetat merupakan fase gerak terpilih yang dapat memberikan keterpisahan noda yang banyak dan memberikan spektrum daya antioksidan yang paling luas. Eluen yang terpilih tersebut akan digunakan untuk fraksinasi dengan metode kromatografi kolom.
Selanjutnya penelitian secara kromatografi kolom juga dilakukan oleh Hayani (2007) dalam jurnal “Pemisahan Komponen Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi Kolom”. Pemisahan komponen rimpang temu kunci secara kromatografi kolom bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa aktifnya. Untuk pengisian kolom, sebagai bahan pengisi bagian bawah kolom dimasukkan sedikit kapas, wol kaca dan pasir laut kemudian dimasukkan bubur silica gel 70-230 mesh sambil diaduk agar tidak terdapat rongga udara di tengahtengah kolom. Timbunan bubur silica gel dalam kolom mencapai tiga perempat tinggi kolom.
Untuk pemisahan komponen dengan menggunakan kromatografi kolom, mula-mula ke dalam kromatografi kolom dialirkan ekstrak rimpang temu kunci, kemudian kran kromatografi kolom dibuka. Ekstrak akan meresap ke silica gel dalam kolom sampai batas atas silika gel. Setelah itu dimasukkan pereaksi terus-menerus sambil kran kolom dibuka. Fraksi yang terpisah ditampung dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml sampai seluruh ekstrak terpisahkan. Dari hasil analisis mutu simplisia temu kunci diperoleh kadar sari yang terlarut dalam air 4,35%, lebih besar dibanding kadar sari yang terlarut dalam alkohol (2,24%). Hal ini menunjukkan simplisia temu kunci mudah larut dalam air. Kadar abu sangat kecil yaitu 0,41%, yang menunjukkan bahwa simplisia temu kunci sangat sedikit tercemar bahan asing seperti pasir.
2. TUJUAN PERCOBAAN
Adapun tujuan dari kromatografi kolom yaitu pemisahan komponen campuran zat berdasarkan afinitas terhadap komponen zat terhadap fasa diam (zat penyerap).
3. TINJAUAN PUSTAKA
1.1. Silika Gel
Kurk Silika gel adalah substansi-substansi yang digunakan untuk menyerap kelembaban dan cairan partikel dari ruang yang berudara/bersuhu. Silika gel juga membantu menahan kerusakan pada barang-barang yang mau disimpan. Silika gel lebih sering digunakan dibandingkan activated carbon untuk beberapa senyawaan, seperti:
· Senyawaan polar, akan lebih mudah didesorpsi dari silica gel dibandingkan charcoal.
· Senyawaan amina, senyawaan nitro dan beberapa senyawaan anorganik (contoh ; Acid mist) tidak dapat dikumpulkan pada charcoal.
Salah satu kelemahan utama silica gel adalah higroskopis (mudah menyerap air). Silika gel mempunyai afinitas yang tinggi terhadap air. Jika pengambilan sampel dilakukan pada atmosfer yang lembab, maka uap air akan diadsorpsi pada silica gel, sehingga mengurangi kapasitas adsorpsinya. Bahkan apabila kelembapan sangat tinggi, dan karena air memiliki polaritas yang tinggi dapat menggantikan senyawaan yang kurang polar yang telah teradsorpsi pada silica gel, sehingga hasil pengukuran menjadi berbeda (Lestari, 2010).
1.2. Prinsip Kromatografi Kolom
Prinsip metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang cukup lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relatif kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam (Hendayana, 2006: 2-3).
Untuk memisahkan campuran, kolom yang telah dipilih sesuai campuran diisi dengan bahan penyerap seperti alumina dalam keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan batang pengaduk untuk memanfaatkan adsorben dan gelas wool pada dasar kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok.
Sejumlah cuplikan yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam campuran diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom. Dengan penambahan pelarut secara terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap apabila suatu komponen yang satu dengan yang lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan (Yazid, 2005: 200-201).
 |
| Gambar Kromatografi Kolom |
4. ALAT DAN BAHAN
4.1. ALAT
No
|
Nama Alat
|
Ukuran
|
Jumlah
|
Gambar
| |||
1
|
Timbangan
|
-
|
1
|  | |||
2
|
Gelas ukur
|
25 mL
|
1
|  | |||
3
|
Kolom kromatografi
|
-
|
1
|  | |||
4
|
Gelas kimia
|
100 mL
|
1
|  | |||
6
|
Batang pengaduk
|
15 cm
|
1
|  | |||
7
|
Spatula
|
15 cm
|
1
|  | |||
8
|
Pipet tetes
|
-
|
1
|  | |||
9
|
Kaca arloji
|
-
|
1
|  |
4.2. BAHAN
No
|
Nama Bahan
|
Ukuran
|
Gambar
| |||
1
|
Silikon oksida
|
20 gram
|  | |||
2
|
1-Butanol
|
20 mL
|  | |||
3
|
KMnO4
|
2,5 mL
|  | |||
4
|
K2Cr2O7
|
2,5 mL
|  | |||
5
|
Aqua dm
|
100 mL
|  |
5. PROSEDUR KERJA DAN PENGAMATAN
No
|
Prosedur Kerja
|
Pengamatan
|
Reaksi
| |||
1
|
Ke dalam kolom yang bersih, dimasukkan penyerap silika gel yang dibasahi dengan air (menjadi larutan kental) setinggi 10 cm.
|  |
-
| |||
2
|
Ditambahkan pelarut 1-butanol (eluen) hingga mencapai 1 cm diatas permukaan penyerap (jaga agar penyerap jangan sampai kering).
|  |
-
| |||
3
|
Dimasukkan 5 ml sampel (campuran larutan KMnO4 dan larutan K2Cr2O7).
|  |
-
| |||
4
|
Dimasukkan fase diam dan fase gerak kedalam kolom. Sehingga terjadi proses fraksinasi.
|  |
-
|
6. PEMBAHASAN
Percobaan ini dilakukan dengan metode kromatografi kolom, untuk memisahkan campuran larutan antara kalium permanganat dan larutan kalium dikromat yang telah dihomogenkan. Fase diam yang digunakan adalah silika gel sedangkan fase gerak yang digunakan adalah pelarut 1-butanol. Silika gel digunakan sebagai fase diam karena silika gel memiliki pori-pori dan tidak mudah bereaksi dengan senyawa-senyawa organik pada kolom. Pelarut 1-butanol merupakan senyawa organik polar, Dicampurkan larutan KMnO4 dan K2Cr2O7 kedalam gelas kimia maka dihasilkan larutan berwarna merah darah. Lalu dimasukkan larutan tersebut kedalam kolom yang sudah berisi silika gel. Sampel tersebut membutuhkan waktu lama untuk menuruni kolom (proses fraksinasi lama), tetapi ketika ditambahkan 1-butanol komponen-komponen sampel sangat cepat menuruni kolom. Hal ini terjadi karena perbedaan kepolaran antara 1-butanol dan sampel yang dianalisis, dimana 1-butanol lebih polar daripada sampel sehingga 1-butanol mempunyai kemampuan berikatan lebih besar dengan sampel. Ini berarti sampel harus diserap secara kuat pada silika gel dibandingkan dengan 1-butanol sehingga 1-butanol lebih dahulu menuruni kolom. Hasil yang diperoleh pada percobaan ini berupa 3 fraksi. Fraksi pertama merupakan larutan tidak bewarna, kedua larutan bewarna kuning dan ketiga larutan berwarna ungu.
Hasil percobaan diatas sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang cukup lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran (Hendayana, 2006:2-3). Kemudian hasil ini juga sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan oleh Endah Sayekti, Ajuk Sapar, Titin Anita Zaharah dan Fitririyanti (2013:133) “Isolasi Rhodinol dari Minyak Sereh Jawa Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan”. Kromatografi kolom terbagi dua, yaitu kromatografi fasa normal dan kromatografi fasa terbalik, percobaan ini menggunakan kromatografi fasa terbalik. Kromatografi fasa terbalik yaitu adsorben yang digunakan bersifat nonpolar, sedangkan eluennya bersifat polar dan sampel juga bersifat polar. Silika gel yang merupakan adsorben bersifat nonpolar, sedangkan 1-butanol sebagai eluen dan KMnO4 dan K2Cr2O7 sebagai sampel bersifat polar. Hal ini sesuai dengan metode yang digunakan pada percobaan ini kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel yang bersifat nonpolar dan fasa gerak yaitu toluen 100% dan toluen : etil asetat = 12:0,1 ; 12:0,5 dan 12:0,7 yang bersifat polar. Sehingga pada kedua percobaan ini menghasilkan beberapa fraksi. Fraksi awal yang akan keluar merupakan senyawa nonpolar kemudian diikuti dengan senyawa yang bersifat semipolar dan selanjutnya senyawa bersifat polar.
7. PENUTUP
7.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan terjadi pemisahan senyawa KMnO4 dan senyawa K2Cr2O7 berdasarkan afinitas terhadap senyawa tersebut dengan fase diam berupa silika gel dan fase gerak berupa pelarut 1-butanol diperoleh 3 fraksi yaitu larutan 1-butanol, larutan kalium dikromat, dan kalium permanganat. Metode ini dapat memisahkan antara senyawa yang polar dan nonpolar. Senyawa yang non polar akan lebih cepat keluar dari keran kolom daripada senyawa yang polar.
7.2. Saran
· Praktikan harus membasahi silika gel yang sudah dimasukkan kedalam kolom, agar kolom tidak retak atau pecah.
· Diharapkan untuk menggunakan pelarut eter dan metanol dengan perbandingan 1:1 dan etanol dan kloroform dengan perbandingan 1:1.
· Gunakanlah fase diam berupa aluminium oksida.
· Pengisian bahan penyerap harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok.
8. DAFTAR PUSTAKA
Diyan Maya Sari, Sumi Wijaya, Henry Kurnia Setiawan. 2015. Fraksinasi dan Identifikasi Senyawa antioksidan pada Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) secara Kromatografi Kolom. Jurnal Farmasi Sains Dan Terapan, Vol. 2, No. 2.
Endah Sayekti, Ajuk Sapar, Fitririyanti, Titin Anita Zaharah. 2013. Isolasi Rhodinol dari Minyak Sereh Jawa Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan. Semirata, Vol, 2. No, 1.
Eni Hayani. 2007. Pemisahan Komponen Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi Kolom. Buletin Teknik Pertanian, Vol. 12 No. 1.
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohma., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka pelajar.
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan. Bandung: Remaja Rosdakarya.
Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB.
Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika Paramedis. Yogyakarta: Andi.
0 komentar:
Posting Komentar